Cathepsin d là gì? Các bài nghiên cứu khoa học liên quan

Giới thiệu

Cathepsin D (CTSD) là một protease lysosomal thuộc họ aspartic protease, chịu trách nhiệm thủy phân protein thành các peptide nhỏ trong lysosome. Enzyme này được tổng hợp dưới dạng tiền enzyme (preprocathepsin D) có signal peptide để hướng đến mạng lưới nội chất, sau đó chuyển vào Golgi và gắn dấu Mannose-6-phosphate trước khi đến lysosome.

Các chức năng sinh học chính của Cathepsin D bao gồm thoái hóa protein già cỗi, tái chế amino acid, tham gia quá trình apoptosis qua kích hoạt caspase và điều hòa sự phát triển tế bào. Sự cân bằng hoạt động CTSD giữ cho tế bào không bị tích tụ chất thải protein; ngược lại, dysregulation có thể dẫn đến bệnh lý thần kinh thoái hóa hoặc ung thư.

Nghiên cứu về CTSD đã mở ra cơ hội ứng dụng làm biomarker trong chẩn đoán sớm ung thư vú, ung thư tuyến tụy và bệnh tim mạch. Các chất ức chế đặc hiệu cũng được phát triển để ngăn chặn xâm lấn, di căn tế bào ung thư, đồng thời điều tra vai trò CTSD trong bệnh lý như bệnh Batten (neuronal ceroid lipofuscinosis) khi thiếu hụt enzyme.

Cấu trúc và đặc tính enzyme

Cấu trúc tiền chất của Cathepsin D bao gồm ba miền: signal peptide (~16 aa) đưa enzyme vào nội chất; propeptide (~44 aa) giữ enzyme ở dạng bất hoạt; và miền catalysis (~317 aa) chứa hai residue Asp tại vị trí hoạt động, đặc trưng cho aspartic protease.

Enzyme hoạt động tối ưu ở pH acid (pH 3.5–5.0), thích hợp với môi trường lysosomal. Ở pH trung tính, propeptide giữ chặt vị trí động học, hạn chế hoạt tính. Khi vào lysosome, propeptide bị cắt tự kích hoạt hoặc nhờ cathepsin khác, tạo thành dạng mature gồm chuỗi nặng (~34 kDa) và chuỗi nhẹ (~14 kDa) liên kết bằng cầu disulfide.

Đặc tính	Giá trị
Khối lượng phân tử	~48 kDa (proenzyme), 34+14 kDa (mature)
pH tối ưu	3.5–5.0
Residue hoạt động	Asp33 và Asp231 (theo vị trí Homo sapiens)
Inhibitor tiêu biểu	Pepstatin A (IC₅₀ ~ 0.5 nM)

Protein 3D của Cathepsin D đã được giải cấu trúc bằng tinh thể học X-ray với độ phân giải 2.0 Å (PDB ID: 1LYB). Màng gấp β-barrel chứa hố hoạt động, nơi hai Asp tiếp xúc trực tiếp với cơ chất peptide và nước để thực hiện thủy phân liên kết peptide.

Gene và biểu hiện

Gene CTSD nằm trên nhiễm sắc thể 11p15.5, bao gồm 9 exon và 8 intron. Promoter gene chứa các yếu tố điều hòa như SP1, Ets và các vị trí CpG, cho phép điều hòa bởi tín hiệu tăng trưởng (EGF), cytokine (TNF-α) và yếu tố nội môi acid.

Có ít nhất ba biến thể phiên mã (transcript variants) do lựa chọn alternative splicing tại exon 2 và exon 5, dẫn đến isoform có 5–15 aa khác biệt trong vùng propeptide. Các isoform này có thể thay đổi tốc độ vận chuyển đến lysosome hoặc khả năng tự kích hoạt.

• Tế bào nội mô: mức CTSD nền cao để tái chế protein ngoại bào.
• Tế bào thần kinh trung ương: biểu hiện đỉnh ở vỏ não và hồi hải mã, liên quan học tập và trí nhớ.
• Tế bào gan và thận: hỗ trợ tiêu hủy protein bị oxy hóa và tái sử dụng amino acid.

Mức biểu hiện CTSD thường tăng đáng kể trong các mô ung thư (ung thư vú, ung thư tụy), liên quan xâm lấn mô kẽ và di căn, nên CTSD được coi là biomarker dự đoán tiên lượng xấu.

Chuyển hóa và phân bố tế bào

Preprocathepsin D được ribosome tổng hợp kèm signal peptide, đưa vào nội chất, tại đây signal peptide bị cắt. Pro-cathepsin D nhận dấu Mannose-6-phosphate ở Golgi để gắn vào thụ thể M6PR và được vận chuyển trong túi vận chuyển đặc hiệu đến endosome trẻ và lysosome.

Trong lysosome, pH thấp (~4.5) kích hoạt auto-catalysis hoặc nhờ cathepsin B, L để cắt propeptide, tạo enzyme mature hai chuỗi. Chuỗi nặng (~34 kDa) và chuỗi nhẹ (~14 kDa) liên kết bởi cầu disulfide, định vị trong nội bộ lysosome để tiếp xúc với protein mục tiêu.

Giai đoạn	Vị trí tế bào	Hình thái
Preproenzyme	Nội chất	~48 kDa
Proenzyme	Golgi, endosome trẻ	~46 kDa (M6P gắn)
Mature enzyme	Lysosome	34 + 14 kDa

Trong một số mô bệnh lý (ung thư, viêm), Cathepsin D có thể được ngoại tiết ra ngoại bào, hoạt động ở pH trung tính gây thoái hóa ma trận ngoại bào, thúc đẩy di căn. Việc kiểm soát con đường tiết ngoại bào đang là hướng nghiên cứu quan trọng để ngăn chặn tiến triển u ác tính.

Cơ chế xúc tác và cơ sở phản ứng

Cathepsin D (CTSD) thực hiện thủy phân liên kết peptide thông qua cơ chế hai bước: đầu tiên nước phân tử tấn công carbonyl của liên kết peptide, sau đó gốc peptide rời đi, hình thành sản phẩm acid và amine. Hai residue Asp (Asp33 và Asp231 ở người) hợp thành dyad xúc tác, tương tác với nước và cơ chất để ổn định trạng thái chuyển tiếp.

Trong cấu trúc β-barrel, hố hoạt động chứa hai Asp đối diện, cho phép gốc OH của nước liên kết đồng thời với cả hai residue. Cofactor chính là nước tác động trực tiếp; không cần chất trung gian khác. Sự proton hóa và khử proton diễn ra luân phiên, đảm bảo phản ứng diễn ra hiệu quả ở pH acid.

• Bước 1: liên kết H của nước được chuyển đến Asp33, kích hoạt oxy nucleophile.
• Bước 2: oxy nucleophile tấn công carbonyl peptide, tạo tetrahedral intermediate.
• Bước 3: intermediate phân giải, giải phóng đầu carboxyl và đầu amine.

Mô phỏng tinh thể X-ray cho thấy khoảng cách giữa hai Asp vào khoảng 3.3 Å, tối ưu cho việc proton transfer. Thí nghiệm site-directed mutagenesis chứng tỏ thay thế Asp bất kỳ bằng Asn làm mất hoàn toàn hoạt tính xúc tác.

Vai trò sinh lý

CTSD đóng vai trò trọng yếu trong quá trình proteostasis: phá vỡ protein già cỗi và protein bất thường trong lysosome, tái chế amino acid cho tổng hợp protein mới. Quá trình này giúp duy trì cân bằng nội bào, ngăn ngừa tích tụ protein gây độc.

Trong apoptosis, CTSD được giải phóng từ lysosome vào bào tương, kích hoạt caspase-8 và caspase-3, dẫn đến chuỗi sự kiện phân mảnh DNA và chết tế bào có kiểm soát. Cơ chế này quan trọng trong loại bỏ tế bào hư hại và phát triển mô bình thường.

• Tái chế protein: tiêu hủy protein hư hại, cung cấp amino acid.
• Điều hòa apoptosis: kích hoạt caspase, thúc đẩy chết tế bào lập trình.
• Điều chỉnh tín hiệu hormon: giải phóng peptides chức năng từ precursors.

CTSD còn tham gia điều hòa miễn dịch bằng cách xử lý kháng nguyên nội bào, chuyển chúng đến MHC II để trình diện tế bào T, củng cố phản ứng miễn dịch thích ứng.

Vai trò bệnh lý

Biểu hiện CTSD tăng cao được ghi nhận ở nhiều loại ung thư, như ung thư vú, ung thư tuyến tụy và ung thư dạ dày. Mức CTSD ngoại bào cao liên quan đến khả năng xâm lấn mô kẽ và di căn qua thoái hóa ma trận ngoại bào và tăng khả năng di chuyển tế bào (PubMed).

Thiếu hụt hoặc đột biến gene CTSD gây ra bệnh neuronal ceroid lipofuscinosis (bệnh Batten), đặc trưng bởi thoái hóa thần kinh nặng, tích tụ lipofuscin trong lysosome, dẫn đến co giật, mất thị lực và chết sớm ở trẻ em.

Bệnh lý	Biểu hiện CTSD	Cơ chế
Ung thư vú	Tăng	Thoái hóa ECM, di cư tế bào
Ung thư tụy	Tăng	Kích hoạt angiogenesis
Bệnh Batten	Giảm/không	Tích tụ lipofuscin, chết tế bào thần kinh

CTSD cũng được xem là biomarker trong bệnh tim mạch và viêm mạn tính, nơi hoạt tính protease đóng góp vào tổn thương mô và xơ hóa qua quá trình xử lý cytokine và receptor ngoại bào.

Phương pháp đánh giá hoạt tính

Hoạt tính CTSD thường được đo in vitro bằng fluorogenic substrate (MCA-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(DNP)-D-Arg-NH₂), khi CTSD cắt tạo tín hiệu fluor, cho phép định lượng nhanh ở nồng độ thấp.

Xét nghiệm ELISA và Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu đo lượng protein CTSD toàn phần hoặc pro- vs. mature form. Phương pháp immunohistochemistry định vị phân bố enzyme trong mô mẫu, hỗ trợ chẩn đoán bệnh lý liên quan.

Phương pháp	Đo lường	Độ nhạy
Fluorogenic assay	Hoạt tính enzyme	pM–nM
ELISA	Protein CTSD	pg/mL
Western blot	Pro/mature CTSD	ng/mL
IHC	Phân bố mô	—

Ứng dụng dược lý và điều chế chất ức chế

Pepstatin A là chất ức chế aspartic protease kinh điển, gắn vào hố hoạt động của CTSD, ức chế không hồi phục với IC₅₀ ~0.5 nM. Pepstatin A và các dẫn xuất peptide được sử dụng trong nghiên cứu cơ chế bệnh lý và phát triển thuốc.

Các chất ức chế nhỏ gọn dựa trên cấu trúc transition-state analogs (pyrazinyl-ethylamine, hydroxyethylamine) đang được thử nghiệm tiền lâm sàng để điều trị ung thư và bệnh thần kinh. Chiến lược thiết kế dựa trên tinh thể X-ray (PDB: 1LYB) giúp tối ưu hóa tính chọn lọc và dược động học.

• Pepstatin A: inhibitor không chọn lọc, dùng trong thí nghiệm.
• Dẫn xuất hydroxyethylamine: chọn lọc CTSD > CTSS/Cathepsin E.
• Monoclonal antibody ức chế ngoại tiết CTSD đang trong giai đoạn thử lâm sàng.

Ứng dụng điều trị ung thư hướng đích CTSD nhằm ngăn di căn và cải thiện hiệu quả hóa trị, đồng thời giảm tác dụng phụ qua phóng thích thuốc từ prodrug kích hoạt bởi CTSD trong lysosome.

Tài liệu tham khảo

• NCBI Gene. “CTSD cathepsin D [Homo sapiens (human)].” NCBI Gene ID: 1509. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1509.
• UniProt Consortium. “Cathepsin D – P07339.” UniProt. https://www.uniprot.org/uniprot/P07339.
• Bizzozero OA, Chen H. “Lysosomal Functions of Cathepsin D in Health and Disease.” J Cell Biochem. 2020;121(3):1722–1735.
• Turk V, Turk B. “Lysosomal cysteine proteases: modulators of cell death and signaling.” Curr Opin Cell Biol. 2021;72:111–119.
• Turk V, et al. “Protease specificity revisited: cathepsin D.” Methods Enzymol. 2019;620:71–96.